巴西蘑菇

作者:风中的自由
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发布时间:2017-11-08 11:47:29
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1.香港中药与天然药物研究所林华型;2.中国科学院昆明植物研究所刘培贵;3. 云南中医学院中药学院杨树德
 
摘要:本文采用经典分类学和分子系统学方法,对引种栽培获得巴西蘑菇子实体进行系统分类学鉴定、显微特征鉴定和拉丁学名的考证。结果表明,所获得的子实体形态解剖宏微观特征比较研究,以及DNA分子ITS序列构建的系统发育树显示,与GenBank中6条巴西蘑菇的序列聚类在一起,支持率达到100%,确认为真菌界、担子菌门、伞菌纲、蘑菇科、蘑菇属中的巴西蘑菇;同时对巴西蘑菇拉丁学名进行了文献跟踪考证,发现Agaricus blazei Murrill为常用的误用名称。按照国际命名法规及优先权的原则,论证Agaricus subrufescens才是巴西蘑菇有效正确的拉丁学名。为名称的正确应用、保护野生原种、确保质量及进一步研发提供科学理论依据。
[中图分类号] R9     [文献标识码] A          文章编号:
巴西蘑菇(Agaricus subrufescens)是一种药食兼用的大型真菌。
中文别名:姬松茸、松蕈菇、香蕈菇、小松菇、太阳菇、柏拉氏蘑菇、赭鳞黑伞;
拉丁学名:Agaricus subrufescens Peck;
系统学位置:菌物界(Fungi),担子菌门(Basidiomycota),伞菌纲(Agaricomycetes),伞菌目(Agaricales), 伞菌科(Agaricaceae),蘑菇属 (Agaricus)。如下图所示:

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                                                                                 1:巴西蘑菇子实体菌生长             图2:巴西蘑菇药材干品
本品确认为白色至黄棕色,味甘,性平;具有杏仁味,无毒。近来,巴西蘑菇在药学界越来越受到关注。同时,也是我国的传统中药材,如最早收载于
 
宋代时《菌谱》记载,“松蕈:尿浊不禁,吃后有效”;《本草纲木》中记载:“香蕈:味甘,性平,无毒。主益气不饥,治破血”、《本草求原》书中记载:“香蕈专入胃,食中佳品,味甘性平。大能益胃助食,及理小便不禁”。《中国食药菌学》专著中也有记载:临床应用上具增强机体的免疫能力。促进肝脏保护、促进胃肠消化功能等作用,有效缓解恶性肿瘤细胞放疗或化疗所致上述不良反应,在抗肿瘤作用方面也可与化疗药物产生协同效应。
1 实验材料
1.1 标本: 本实验所用标本存放于中国科学院昆明植物研究隐花植物标本馆(KUN-HKAS),标本馆标本编号:KUN-HKAS80633。
1.2 显微观察用试剂
亚甲蓝(MB,瑞士adamas-beta,批号:P10571),中性树胶(上海标本模型厂),石蜡(熔点50~52℃)(上海华申康复器材厂),水合氯醛,丙三醇,醋酸,KOH,TO型生物制片透明剂,其余试剂均为分析纯。图
1.3 分子实验用试剂的制备
1mol/L Tris-HCl:将12.11g Tris溶解于90mL dH2O中,加入浓盐酸调节pH至所需值,加dH2O定容至100mL,使最终浓度为1mol/L,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
0.5mol/L EDTA(pH8.0):将46.5g EDTA·Na·2H2O(二水乙二胺四乙酸二钠)溶解于200mL dH2O中,在磁力搅拌器上搅拌,用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约需要5g NaOH颗粒),然后用dH2O定容至250mL,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
50×TAE的配制:将242g Tris溶于500 mL dH2O中,加入57.1mL冰醋酸,100mL0.5mol/L EDTA(pH8.0),然后用dH2O定容至1000mL,备用。
4×CTAB 缓冲液:将100mL1mol/L Tris-HCl,40 mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),82g NaCl,40g CTAB溶于800 mLdH2O中,在磁力搅拌器上搅拌至全部溶解,定容至1000 mL,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
去多糖Buffer:将100mL1mol/L Tris-HCl,50 mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),7.305g NaCl,溶于300 mL dH2O中,在磁力搅拌器上搅拌,定容至500 mL,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
5mol/L醋酸钾:将49.1g醋酸钾(KAc)溶解于90mL dH2O中,加dH2O定容至100mL,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
1mol/L CaCl2:在超净台中将11.1g CaCl2溶解于灭过菌的80mL dH2O中,定容至100mL,分装成10mL小份,置冰箱-20℃保存备用。
TE缓冲液:80mL dH2O中加入1mol/L Tris-HCl(pH8.0)1mL和0.5mol/L EDTA(pH8.0)200μL,混匀,加dH2O定容至100mL,1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min,备用。
2.仪器、设备和工具
2.1 显微观察仪器和材料:组织切片机(莱卡),80i生物数码摄影显微镜(本Nikon),恒温水浴锅(深圳国华仪器厂),101A-2电热干燥箱,高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),80i生物数码摄影显微镜(日本Nikon)。测量与记载。
2.2 切片用工具和材料:上海吉列刀片有限公司“飞鹰牌”S-74型不锈钢双面刀片。使用时将其掰成两半,每次使用其中一半。菌褶、盖表皮、菌柄皮的切片均用首次开封刀片切取。切片在莱卡L2体式显微镜(解剖镜)下操作。
2.3 分子实验仪器设备:AIR TECH 型超净工作台、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器、HWS-24型水浴锅、DHG-9070A型烘箱、SORCALL PICO型离心机、BAY GENE BIOTECHNOLOGY专用电泳槽、WD-9403型紫外仪、研钵、移液枪、离心管等。
3 试验方法
3.1性状特征比较
运用生药学性状鉴别研究方法,对云南省陇川县食用菌协会提供的试验材料(巴西蘑菇)进行观察,记录其性状特征。
3.2显微特征
3.2.1 组织切片制备
3.2.1.1  固定:将新鲜材料固定于F.A.A固定液(50%乙醇90ml+冰醋酸5ml+福尔马林即38%甲醛5ml )中。
3.2.1.2  脱水:将材料依次转移到70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇中脱水,每级3小时。后用无水乙醇浸泡两次使脱水完全,每次10分钟。
3.2.1.3  透明:脱水后将材料依次放于正丁醇/无水乙醇(1:1)、正丁醇/无水乙醇(4:1)和正丁醇(重复1次)中透明。正丁醇/无水乙醇(1:1)1小时,后每级30分钟。
3.2.1.4  浸蜡:透明后在正丁醇溶液中少量多次加入已熔化的石蜡;待石蜡/正丁醇为1:1时,倒出混合溶液,加入纯石蜡浸蜡24~48小时,浸蜡温度为55
3.2.1.5  包埋:浸蜡完全后将材料包埋于石蜡中,待完全凝固后修整蜡块成适当形状,黏附于切片机蜡座上,切片。
3.2.1.6  切片和展片:将材料切成8~10μm的切片,将切片小心放入滴有蒸馏水的干净的载玻片上后置于恒温台上展片,待切片完全展开后用吸水纸吸去蒸馏水。
3.2.1.7  烘片:将展片后的片子置于电热干燥箱中烘片24小时,烘片温度为36
3.2.1.8  染色和封片:初检后,以二甲苯熔蜡两次,每次30分钟,后依次放入二甲苯/无水乙醇(1:1)、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中,每级15分钟,然后放入0.02%MB(50%乙醇溶液)中染色2min,后放入0.1%固绿(95%乙醇溶液)中对染10秒,用TO/无水乙醇(1/3)、TO/无水乙醇(1/1)、TO洗去残留的固绿。切片从TO中取出后直接用中性树胶封片。
2.2.1.9  生物数码摄影显微镜观察,拍照。
3.2.2 粉末片制备
    干燥样品粉碎,过四号筛。取少许粉末放于干净的载玻片上,滴加蒸馏水,封片,观察菌丝形态特征。另取少许粉末于另一个干净的载玻片上,滴加5%KOH溶液,封片,观察菌丝形态。
3.3  DNA的提取(CTAB法)
3.3.1选取适量的硅胶干燥材料,或从标本上切取适量组织放入小研钵中,加入少量石英砂和PVP(聚乙烯吡咯烷酮polyvinyl pyrrolidone,简称PVP),液氮冷冻5s,室温下用研杵迅速用力研磨,直至材料呈粉末状,细腻均匀。
3.3.2将研磨后粉末转移至1.5ml离心管中,加入去多糖Buffer 700 μl,利用研杵和牙签使其与材料充分混匀,冰浴30min。
3.3.3用5000 r/min离心5分钟,弃上清。
3.3.4取出离心管,再加入65℃预热的4×CTAB溶液500 μl,充分混匀,65℃水浴1 h,期间不定时轻摇。
3.3.5在离心管中加入去5M醋酸钾溶液200 μl,冰浴20min。
3.3.6冰浴后取出离心管,加入500μl的氯仿-异戊醇(V:V,24:1),轻摇2~3分钟,10000 r/min离心10分钟,取上清。
3.3.7在离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇(V:V,24:1),轻摇2-3分钟,10000 r/min离心10分钟,取上清。
3.3.8加入2/3体积的无水乙醇(-20℃预冷),轻摇,放于冰箱-20℃沉降4h 至过夜。
3.3.9从冰箱中取出离心管,10000 r/min离心10分钟,弃上清,注意动作要轻。
3.3.10 用200μl70%乙醇洗两次,无水乙醇洗一次,每次洗涤离心13000 r/min离心2分钟。
3.3.11将离心管放于37℃烘箱使乙醇挥发。
3.3.12 干燥后,加入50 μl TE(或灭过菌的ddH2O)溶液,保温30min。
3.3.13  用1% 琼脂糖凝胶电泳检测后置于-20℃保存备用。
4结果与分析详见如下各部分的具体描述。
4.1巴西蘑菇的显微观察,特征如下(详见如下各部分的具体描述)
 4.1.1菌盖
    菌盖表皮菌丝颜色较深,呈平伏辐射状;菌褶离生,密集,边缘担子紧密排列,担孢子球形或近球形,菌髓由菌丝交织而成,菌丝棒状,具横隔,靠近菌褶处菌丝排列较菌髓紧密。
4.1.2 菌柄
菌柄由菌丝交织而成,较疏松,可见空隙,菌丝短棒状,无色,具横隔。         
41..3 粉末
    淡黄色至淡棕色。菌丝圆柱状或波状弯曲,具横隔,直径3~8μm。菌盖表皮菌丝呈浅黄棕色或浅红棕色,排列紧密。菌褶碎片可见子实层和排列紧密的担子,子实层菌丝交织排列,担子长条形,先端钝圆。担孢子球形或近球形,直径3~5μm。

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                                                                       图1:菌柄横切图片                                                                     图2:菌盖切向图片
 

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                                           图3:菌柄纵切图片                           图4:菌盖径向图片

 

                                          图片7.png
 
 
                                                                                        图5:全菌粉末图片
4.2.DNA的分析结果
    (1) PCR扩增  ①采用通用引物ITS1和ITS4,对样品进行分子系统学研究时,所选取的基因片段为内转录间隔区片段ITS的基因片段进行筛选和分析;  ② 反应体系:③反应体系选用25μl体系,包括10×Buffer(with Mg2+)2.5μl,200μM dNTP 2.5μl,1%(牛血清蛋白)BSA 1μl,10μM的引物各1μl,TaqDNA聚合酶0.2-.0.5μl,DNA模板0.4-2μl,双蒸水定容至25μl;PCR扩增反应热循环参数:94℃变性3分钟,然后进入35个循环:94℃变性1分钟,48-53℃退火30秒,72℃延伸1-2分钟,循环结束后72℃延伸10分钟,最后16℃保存。
  (2) PCR扩增反应产物检测  将对照(DNA Marker D 2000)和扩增产物分别取3μl点于塑料薄膜上与溴酚蓝(1% bromophenol blue:1g溴酚蓝溶于100g水中)混匀,点样于1%的琼脂糖凝胶上,于1×TAE缓冲液中(电压梯度4.5-5.5V)中电泳15-20分钟,取出琼脂糖凝胶置于紫外仪上观察并记录结果,阳性产物送上海生工生物工程技术有限公司,用AB13730DNA型号测序仪进行测序。
  (3) DNA序列分析  将最终测序结果输入GenBank中进行比对分析。从基因库中选取6条相似度和覆盖度最高的序列作为比对序列,为更清楚的了解该真菌的分类学地位,本研究同时从基因库中又选取了伞菌科的其他10条序列,其中选牛肝菌Boletus betulicola作为外源对比序列。用BioEdite V7.0.9进行比对分析,构建矩阵,并保存为FASTA格式。用MAGE软件进行系统分析并构建系统发育树(如下图所示)

图片8.png

3.讨论
   经宏微观特征及DNA分子序列对比分析,由云南省陇川县食用菌协会提供陇川县栽培的样品鉴定为真菌界、担子菌门、伞菌纲、蘑菇科、蘑菇属中的巴西蘑菇。
巴西蘑菇的子实体粗壮,有杏仁味;菌盖扁圆形、半圆形、馒头形,直径3~12cm,表面覆有淡茶褐色或褐色的纤维状细小鳞片,通常中央较厚达11mm以上,边缘菌肉渐变薄,有菌幕的碎片悬垂于盖缘,颜色为白色,受伤后变微橙黄色至肉黄色;菌褶离生,较密集,宽6~10mm,从白色转淡黄色至肉粉色,后变为黑褐色;菌柄圆柱状,长4~15cm,直径2~4cm,上下等粗或多数基部膨大成球形,表面近白色,手摸摸或受伤后变色,常变为近黄色,菌环以上最初有粉状至绵屑状小鳞片,后脱落成平滑,中空。菌环着生菌柄的中上部, 双层,向下垂悬,不易脱落,膜质,鲜时初白色,后微褐色,膜下有带褐色绵屑状的附属物。担孢子椭圆形,光滑,暗紫褐色,6~7.5 X 4~5µm
巴西蘑菇相关的DNA分子序列NCBI上共有41条(其中包括多条共生细菌和功能基因的序列),其余多数为ITS序列和LSU序列。在蘑菇属(Agaricus)中ITS序列是很有效的分子序列。另外核糖体大亚基也可以参考使用。 经DNA ITS4/ ITS5 序列系统学对比分析,相似度高达100%,证明所提供的样品系巴西蘑菇。
关于巴西蘑菇拉丁学名的考证:巴西蘑菇学名张冠李戴者情况,名称混乱造成鱼目混杂者时有发生。诸如,现有较多相关记载文献中记载巴西蘑菇使用了拉丁学名的Agaricus blzaei Murrill,甚至在Genbank也多次使用这个拉丁学名称;偶有使用A. brasiliensis Fr.,也有记载Agaricus subrufescens。经查考证结果如下,上述符合拉丁学名命名法规命名的名称,其中学名Agaricus subrufescens 最早是由美国植物学家Charles Horton Peck(1893)描述命名。巴西蘑菇这个物种大约在十九世纪晚期至二十世纪早期,即已人工栽培成功,之后在巴西二十世纪七十年代再次被发现,并被错误地鉴定为原来已报道自佛罗里达的种Agaricus blazei Murrill。由于传说中具有较高的药用价值的关系,即以各种名称风靡市场,造成混乱,其中包括ABM(Agaricus blazei Murill、A. brasiliensis Fr.)。直到2002年,Didukh 和Wasser 才对A. blazei提出异议,而被称之为巴西蘑菇(A. brasiliensis)早已被使用(Fries,1830)。Richard Kerrigan 做了相关几个物种的交配试验,结果表明A. blazeiA. brasiliensis 和种群Agaricus subrufescens是同一种,而且与发现于欧洲的种的 A. rufotegulis也是同一种。这些物种的拉丁名称中Agaricus subrufescens 是最早的,具有分类学的优先权。因此Agaricus subrufescens应为巴西蘑菇正确有效的拉丁学名。
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